Caracterización molecular de 54 accesiones de guanábana (annona
muricata l.) y 60 de mango (mangifera indica l.) a
través de marcadores genéticos moleculares
Molecular
characterization of 54 accessions of soursop (annona
muricata l.) And 60 of mango (mangifera indica l.) using molecular genetic markers
Artículo
resultado de proyecto de investigación financiado por
La Universidad Estatal de Santa Elena
Armas Moreno Mónica Isabel
Universidad Estatal de Santa Elena
https://orcid.org/ 0000-0002-4467-9348
monica.armasm@upse.edu.ec
Santa Elena Ecuador
Javier Soto Valenzuela
Universidad Estatal de Santa Elena
https://orcid.org/ 0000-0002-0815-6689
Javier.sotov@upse.edu.ec
Santa Elena- Ecuador
http://centrosuragraria.com/index.php/revista
Publicada por: Instituto Edwards Deming
Quito - Ecuador
Julio - Diciembre
vol. 1. Num. 4 2019
Esta obra está bajo una Licencia Creative Commons
Atribución-NoComercial-CompartirIgual 4.0
Internacional.
RECIBIDO: 23 DE JUNIO 2018
ACEPTADO: 9 DE NOVIEMBRE 2018
PUBLICADO: 4 DE JULIO 2019
RESUMEN
Los frutales forman parte de la diversidad de plantas comestibles, muchas de ellas todavía silvestres y localizadas principalmente en las regiones tropicales. La investigación y el desarrollo de la agricultura en el mundo se han limitado a unas 150 especies, dejando a un lado otras con potencial económicoEn el país el Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP) con su Estación Experimental del Litoral Sur (EELS) a través del Programa de Fruticultura posee una colección con 54 accesiones de guanábana, provenientes de diferentes provincias de la costa como Esmeraldas, Manabí, Guayas, Los Ríos y El Oro y de la sierra ecuatoriana como Santo Domingo, Azuay y Loja e incluso algunas introducidas de Brasil, encontrándose al momento esta colección en la etapa de caracterización agromorfológica. El nivel de importancia económica que tiene este cultivo en el país conlleva a garantizar su conservación, por lo cual, el Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias con su Estación Experimental Portoviejo, mantiene un Banco de Germoplasma con trece variedades tradicionales, de las cuales cinco son de Ecuador, tres de Israel y tres de Estados Unidos (KNUDSEN, 2000); todas ellas conservadas en campo, lo que representa la variabilidad genética existente en el país. En la actualidad la detección de polimorfismos genéticos se ha llevado a cabo mediante diversos métodos, entre ellos la utilización de marcadores moleculares, que brindan una excelente vía para obtener una gran cantidad de datos sobre los procesos de conservación que pueden dar origen a patrones de variación, proporcionando información que resulta de gran utilidad para un eficiente manejo y explotación de la variabilidad presente en las colecciones o bancos de germoplasmas.
PALABRAS CLAVE: origen, clasificación taxonómica
ABSTRACT
Fruit trees are part of the
diversity of edible plants, many of them still wild and located mainly in
tropical regions. The research and development of agriculture in the world have
been limited to some 150 species, leaving aside others with economic potential In
the country, the National Autonomous Institute of Agricultural Research (INIAP)
with its Experimental Station of the South Coast (EELS) a Through the Fruit
Growing Program, it has a collection with 54 accessions of soursop, from
different coastal provinces such as Esmeraldas, Manabí, Guayas, Los Ríos and El
Oro and from the Ecuadorian highlands such as Santo Domingo, Azuay and Loja and
even some introduced from Brazil, this collection being at the moment in the
stage of agromorphological characterization. The
level of economic importance that this crop has in the country leads to
guarantee its conservation, for which reason, the National Institute of
Agricultural Research with its Portoviejo Experimental Station, maintains a
Germplasm Bank with thirteen traditional varieties, of which five are of
Ecuador, three from Israel and three from the United States (KNUDSEN, 2000);
all of them conserved in the field, which represents the existing genetic
variability in the country. Currently, the detection of genetic polymorphisms
has been carried out by various methods, including the use of molecular
markers, which provide an excellent way to obtain a large amount of data on the
conservation processes that can give rise to patterns of variation. , providing
information that is very useful for an efficient management and exploitation of
the variability present in the collections or genebanks.
KEY WORDS: origin, taxonomic classification
INTRODUCCIÓN
Los frutales forman
parte de la diversidad de plantas comestibles, muchas de ellas todavía
silvestres y localizadas principalmente en las regiones tropicales. La
investigación y el desarrollo de la agricultura en el mundo se han limitado a
unas 150 especies, dejando a un lado otras con potencial económico (IPGRI.
2000).
Uno de éstos
grupos es la familia Annonaceae, autóctona del continente americano y
con gran capacidad de crecer en diferentes condiciones tropicales y
subtropicales (BENAVIDES A. 2001); representada en su gran mayoría por el
género Annona, el cual es comestible y conformado por las especies A.
reticulata (anona corazón), A. squamosa (anona), A. purpurea (sincoya),
A. muricata (guanábana), entre otras.
Annona
muricata L. comúnmente conocida como guanábana es originaria de la
región tropical de Sudamérica. Actualmente se cultiva desde el sur de la
Florida hasta el sur de Brasil (FAO, 2006).
CHICAIZA G. et
al, (2003) expresan que es una fruta conocida en el mercado ecuatoriano,
pero no se registra información detallada sobre la misma de acuerdo al III
Censo Nacional Agropecuario, ya que se presenta una reducida información
estadística censal, puesto que la producción de guanábana es esporádica, y
adicionalmente porque es un producto nuevo que forma parte del grupo de los
productos no tradicionales.
MOREIRA R.
(2011, com. pers) acota que el Ecuador en los últimos años ha incrementado la
superficie de este cultivo debido a la demanda de mercados internacionales,
principalmente el colombiano, el mercado local y el de Estados Unidos; el
primero absorbía sobre el 90 % de la producción de este frutal, pero en los
últimos años las exportaciones han tenido un repunte hacia el mercado
norteamericano. Actualmente, el mercado local constituye un eslabón importante
en el consumo de guanábana, debido al cambio de cultura en el consumo de
frutas.
En el país el Instituto Nacional Autónomo de Investigaciones
Agropecuarias (INIAP) con su Estación Experimental del Litoral Sur (EELS) a
través del Programa de Fruticultura posee una colección con 54 accesiones de
guanábana, provenientes de diferentes provincias de la costa como Esmeraldas,
Manabí, Guayas, Los Ríos y El Oro y de la sierra ecuatoriana como Santo
Domingo, Azuay y Loja e incluso algunas introducidas de Brasil, encontrándose
al momento esta colección en la etapa de caracterización agromorfológica.
Así mismo,
tenemos al mango (Mangifera indica L.), el cual es indudablemente
la especie de mayor importancia de las familias de las Anacardiáceas, tanto por
su distribución mundial como por su importancia económica (GALÁN V. 2009).
De acuerdo
con las estadísticas de la Organización de las Naciones Unidas para la
Agricultura y la Alimentación (FAO), desde los años sesenta cuentan niveles de
producción significativos en países como Brasil, Venezuela, Perú, Ecuador,
Paraguay y Colombia.
ARIAS M. et
al., (2004) señalan que en el Ecuador existen alrededor de 9 500 ha. de
mango distribuidas en 180 productores, de las cuales 6 000 a 7 000 están en
producción, concentradas en un 95 % en la provincia del Guayas y el 5 % en Los
Ríos, El Oro y Manabí.
FUNDACIÓN MANGO ECUADOR (2010, en línea) indica que nuestro país
es un importante proveedor de mango entre los meses de Octubre y Febrero con
las siguientes variedades exportables: Tommy Atkins 65 %, Haden, Kent y Keitt
35 %. Los principales exportadores en el 2008, según su participación en las
ventas mundiales, fueron: India 18.9 %, Perú 11.3 % y Brasil 10.5 %.
El nivel de
importancia económica que tiene este cultivo en el país conlleva a garantizar
su conservación, por lo cual, el Instituto Nacional de Investigaciones
Agropecuarias con su Estación Experimental Portoviejo, mantiene un Banco de
Germoplasma con trece variedades tradicionales, de las cuales cinco son de
Ecuador, tres de Israel y tres de Estados Unidos (KNUDSEN, 2000); todas ellas
conservadas en campo, lo que representa la variabilidad genética existente en
el país.
Entre la conservación de recursos genéticos la técnica de
caracterización molecular es una valiosa herramienta para la selección de
especies que presenten características genotípicas de interés, por su
independencia del medio ambiente y el alto nivel de polimorfismo que se puede
encontrar distribuido por todo el genoma (RALLO et al., 2005, citado por
FENDRI M. 2008).
Los
marcadores morfológicos y/o agronómicos siguen siendo utilizados ampliamente ya
que no requieren medios o tecnologías complicadas y también son los únicos
marcadores basados en la observación directa de la planta.
No obstante,
el empleo de descriptores fenotípicos, presenta dificultad en la evaluación de
muchos de los caracteres como por ejemplo los relativos a las inflorescencias.
En
consecuencia, se demanda de personal con experiencia que sea capaz, sobre todo,
de diferenciar entre variabilidad debida a la genética y aquella debida a la
fluctuación ambiental. Dicha experiencia requiere tiempo, y la identificación
con este tipo de marcadores ha llevado en algunos casos a caracterizaciones
erróneas.
Asumiendo la
importancia agronómica de las dos especies a evaluar y teniendo en cuenta la
variación que presenta la caracterización fenotípica, la presente investigación
busca caracterizar a nivel molecular las colecciones del Banco de Germoplasma
de guanábana y mango ex-situ de las Estaciones Experimentales del INIAP
del Litoral Sur y Portoviejo, mediante el uso de marcadores moleculares RAPD'S
y Microsatélites (SSR's) respectivamente.
La caracterización a través de marcadores moleculares, es una valiosa herramienta que tiene varias ventajas, como su independencia del medio ambiente y el alto nivel de polimorfismo que se puede encontrar distribuido por el genoma. El procedimiento es además fiable, rápido y económicamente rentable.
Considerando
la relevancia de estos marcadores, se puede determinar que son los idóneos para
obtener información de polimorfismos, discriminar entre genotipos e identificar
materiales originales y representativos de la variabilidad genética de una
colección, con perspectivas de su uso en programas de mejoramiento genético,
manejo de germoplasma y potencializar al máximo la conservación de la
diversidad genética. Los marcadores moleculares seleccionados para este estudio
con criterios que aseguren discriminación e indiferencia a factores medio
ambientales al tener una naturaleza co-dominante, permitirá eficientemente
establecer el nivel de heterocigosidad en las colecciones evaluadas, establecer
duplicados y asociar eventualmente la variabilidad genética con caracteres
fenotípicos de interés para los mejoradores.
MATERIALES Y
MÉTODOS
La presente investigación fue realizada en el Instituto Nacional
Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), en el Laboratorio de Biotecnología
de la Estación Experimental del Litoral Sur (EELS) “Dr. Enrique Ampuero
Pareja”, ubicado entre las coordenadas geográficas 02° 15' 15" de latitud
Sur y 79° 49' de longitud Occidental a 17 msnm., en el km. 26 al Este de
Guayaquil en la vía Durán-Tambo, parroquia Virgen de Fátima, cantón Yaguachi,
provincia del Guayas. La investigación tuvo una duración de 16 meses.
La colecta del material vegetal de las 54 accesiones de guanábana
se realizó en el lote 1, 6 y vivero de la colección de árboles frutales nativos
del Ecuador del Programa de Fruticultura de la EELS, mientras que las muestras
foliares de las 60 accesiones de mango fueron tomadas de la colección de frutas
tropicales, establecida en el lote Teodomira de la Estación Experimental
Portoviejo (EEP) situada a 01º 12' de latitud Sur y 80º 23' de longitud
Occidental ubicada en la parroquia Lodana, cantón Santa Ana, provincia de
Manabí. Ambas colecciones conservan germoplasmas procedentes de varias
provincias del país.
Las
características climáticas y edafológicas del área donde se mantienen las
colecciones del germoplasma de guanábana y mango son las siguientes:
Guanábana1:
Temperatura
promedio 24,6 º C
Humedad
relativa promedio 83 %
Precipitación
anual 1398 mm
Tipo de suelo
Vertic-Eutropepts
Textura
Franco a Franco-arenosa
pH 5,5 a 6,5
Altitud 17
msnm
Mango2:
Clima
Tropical seco
Temperatura
media anual 26 º C
Humedad
relativa promedio 77 %
Precipitación
medio anual 686,5 mm
Topografía
Plana
Tipo de suelo
Aluvial
Textura
Franco-arcillosa pH 7,3
Altitud 47 msnm
El proceso de extracción de ADN de ambas especies se llevó a cabo
en la EELS, mientras que la fase de caracterización molecular de ambas
colecciones se llevó a cabo en el Laboratorio de Biología Molecular del
Departamento Nacional de Biotecnología de la Estación Experimental Santa
Catalina (EESC) del INIAP, ubicado entre las coordenadas geográficas 0º 22'
15" de latitud Sur y 78º 33' 14" de longitud Oeste en la parroquia
Cutuglahua, cantón Mejía, provincia de Pichincha a 3050 msnm.
De los datos
resultantes de los productos de amplificación mediante PCR tanto para los
marcadores RAPDs (geles de agarosa) y SSRs (geles denaturantes de poliacrilamida)
se generó una matriz binaria de datos (MBD), con el peso molecular de cada
alelo, en donde la presencia de la banda es representada por la unidad (1) y
cero (0) para la ausencia; con las cuales se realizó los siguientes análisis:
Determinación
de marcadores polimórficos
Distancias
genéticas
Análisis de
conglomerados
Análisis de
coancestrías
RESULTADOS
En
la presente investigación se probaron dos protocolos de extracción de ADN: el
método CTAB 2X desarrollado por VIRUEL y HORMAZA (2002) y el protocolo basado
en el método CTAB 5X presentado por EMBRAPA (2010) con modificaciones en el uso
de antioxidantes; determinándose que el método de extracción CTAB 5X produjo
los mejores rendimientos y calidad de ADN. Para la extracción se utilizó una
muestra de 1 g de hoja fresca de guanábana y 1 g de hoja macerada de mango por
accesión, las cuales produjeron promedios de 79.82 ng/μl de ADN para guanábana
y 56,05 ng/μl para mango al ser cuantificados en geles de agarosa y por
fluometría. Los valores de cuantificación se detallan en los Cuadros 4.A y 5.A.
Se
obtuvo ADN de buena calidad y pureza, sin embargo, las muestras extraídas
presentaban una alta concentración de sustancias fenólicas debido a la
oxidación de las hojas colectadas, mostrándose una coloración gris o parda.
Estas sustancias fueron eliminadas adicionando al buffer de extracción
mercaptoetanol al 4 % y PVP (Polivinil pirrolidona) al 1 %, mejorando de esta
manera las muestras de ADN.
Al realizar el test de integridad de las
muestras de mango se observó la presencia de ARN, para esto fue necesario
realizar la digestión de este ácido nucleico mediante un tratamiento con la
enzima ARNasa, adicionando 40 μg/ml para eliminarlo.
Se
realizó la validación del ADN tanto en guanábana como en mango, mediante
marcadores moleculares RAPDs y SSRs respectivamente, obteniendo amplificación
en la mayoría de muestras analizadas; esto demostró que el protocolo utilizado
para cada tipo de marcador fue el adecuado tanto en concentraciones de los
reactivos como en el programa de amplificación para los posteriores procesos de
caracterización.
Se utilizó el primer RAPDs OPW-O1
(5’-CTCAGTGTCC-3’) obteniendo buenos patrones de bandeo para las muestras de
guanábana a excepción de las accesiones G9P1, G17P1, G34P1, G41P2, G42P1 y
G50P1 (Figura 4); para estas accesiones se volvió a realizar pruebas de
amplificación, no obteniendo resultados y separándolas de la caracterización.
La presente investigación utilizó
información generada de marcadores tipo microsatélites, útiles para
caracterización genética en A. cherimola, (ESCRIBANO P. et al.,
2004-2007), proponiendo realizar la transferencia de estos marcadores para A.
muricata. El screening inicial, se realizó con 17 marcadores SSRs (MORILLO
E. y MIÑO G. 2010).
En
las pruebas de transferibilidad hubieron ADNs que no amplificaron tanto en
guanábana como en chirimoya; para verificar esto se realizaron gradientes de
temperaturas de annealing, y así poder determinar la temperatura óptima de la
amplificación, sin embargo no se obtuvieron resultados con los siguientes primers:
SSR-1, SSR-4, SSR-16 y SSR-31.
De
los primers SSRs que se evaluaron con los ADN’s de las accesiones de
guanábana, se pudo demostrar que la mayoría de estos se presentaron como
monomórficos, por lo que se continuó la caracterización de la colección
mediante el uso de marcadores RAPDs.
Posteriormente
al realizar el pre-screening con 90 primers RAPDs, se seleccionaron 10,
y se volvió a evaluar la capacidad de generar polimorfismos; con los que se
obtuvo el mayor número de bandas fueron los siguientes: OPW-01, OPW-04, OPM-02,
OPC-11, OPG-14, OPG-18, OPB-08, OPB-09, OPC-04, OPM-04; finalmente se procedió
a la amplificación con cuatro materiales de A. muricata y un control
negativo, de éstos se eligieron 6 primers que mostraron mayor número de
bandas polimórficas para la caracterización molecular de la colección.
Estos seis primers RAPDs generaron
un total de 39 bandas, de las cuales 24 fueron polimórficas; siendo el marcador
OPG 18 el que mayor número de bandas amplificó.
CONCLUSIONES
El estudio de
la variabilidad genética de 54 accesiones de guanábana (A. muricata L.)
se determinó mediante los marcadores RAPDs: OPG-14, OPB-08, OPB-09, OPC-04,
OPM-04 y OPG-18, este último fue el que mayor número de bandas generó,
reflejado en un 88,89 % de polimorfismo. La variabilidad genética de 60
materiales de mango (M. indica L.) fue determinada a través de los
marcadores microsatélites MiSHRS-1, MiSHRS-4, MiSHRS-18, MiSHRS-32, MiSHRS-36,
MiSHRS-37, MiSHRS-39, MiSHRS-48, MITG-436-2 y MIAC-326. Los marcadores
empleados determinaron bajo nivel de polimorfismos. El análisis de diversidad genética de las
colecciones de guanábana y mango produjeron un valor de Ht=0,40 y Ht=0,438
respectivamente, demostrando que existe diversidad genética entre las
accesiones analizadas; esto se demuestra en la formación de grupos
genéticos. El dendrograma generado para M.
indica L. por el método UPGMA, revela que existe una disimilitud de 0.1,
demostrando una gran correlación entre accesiones, y por tanto la presencia de
accesiones duplicadas. En el caso de A.
muricata L. no existió duplicados. En cuanto a la distancia genética, en M.
indica L. se determinó una alta similaridad entre las accesiones de Chone y
Daule y otra independiente del grupo, que fue el tipo del “Valle del Río
Portoviejo”. En cuanto a los tipos de mango de “Chupar” y “Manzana” se
presentan como un mismo genotipo, mientras que los tipos “Chico y grande”, y
“Miguelillo” presentan mayor distancia genética.
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